Общие физико химические методы анализа препаратов. Биологические методы анализа

Широкое внедрение принципов медицины, основанной на доказательствах, в клиническую практику во многом обусловлено экономическим аспектом. От того, насколько убедительны научные данные о клинической и экономической эффективности методов диагностики, лечения и профилактики, зависит правильность распределения финансовых средств. В клинической практике конкретные решения следует принимать не столько на основании личного опыта или мнения экспертов, сколько исходя из строго доказанных научных данных. Следует обратить внимание не только на бесполезность, но и на отсутствие научно-обоснованных доказательств пользы применения различных методов лечения и профилактики. В настоящее время это положение приобретает особую актуальность, так как клинические исследования финансируются преимущественно производителями медицинских товаров и услуг.

Понятие «evidence-based medicine», или «медицина, основанная на доказательствах», было предложено канадскими учеными из университета Мак Мастера в Торонто в 1990 году. Доказательная медицина- это не новая наука, а скорее новый подход, направление или технология сбора, анализа, обобщения и интерпретации научной информации. Необходимость в медицине, основанной на доказательствах, возникла, прежде всего, в связи с увеличением объема научной информации, в частности в области клинической фармакологии. Ежегодно в клиническую практику внедряются все новые и новые лекарственные средства. Они активно изучаются в многочисленных клинических исследованиях, результаты которых нередко оказываются неоднозначными, а иногда и прямо противоположными. Чтобы использовать полученную информацию, ее необходимо не только тщательно проанализировать, но и обобщить.

Для рационального применения новых лекарственных средств, достижения их максимального терапевтического действия и предупреждения их нежелательных реакций необходимо уже на стадии испытаний получить всестороннюю характеристику препарата, данные обо всех его лечебных и возможных отрицательных свойствах. Одним из основных путей получения новых лекарственных средств является скрининг биологически активных веществ. Следует отметить, что такой путь поиска и создания новых препаратов очень трудоемок - в среднем один заслуживающий внимания препарат приходится на 5-10 тысяч исследованных соединений. Путем скрининга и случайных наблюдений в свое время были найдены ценные препараты, вошедшие в медицинскую практику. Однако случайность не может быть основным принципом отбора новых лекарственных средств. По мере развития науки стало совершенно очевидным, что создание лекарственных препаратов должно базироваться на выявлении биологически активных веществ, участвующих в процессах жизнедеятельности, изучении патофизиологических и патохимических процессов, лежащих в основе развития различных заболеваний, а также углубленном исследовании механизмов фармакологического действия. Достижения медико-биологических наук позволяют все шире проводить направленный синтез веществ с улучшенными свойствами и определенной фармакологической активностью.

Доклиническое изучение биологической активности веществ принято разделять на фармакологическое и токсикологическое. Такое разделение условно, поскольку указанные исследования взаимозависимы и строятся на одних и тех же принципах. Результаты изучения острой токсичности лекарственных соединений дают информацию для последующих фармакологических исследований, которые, в свою очередь, определяют интенсивность и продолжительность изучения хронической токсичности вещества.

Цель фармакологических исследований – определение терапевтической активности препарата, а также его влияния на основные анатомические и физиологические системы организма. В процессе изучения фармакодинамики вещества устанавливают не только его специфическую активность, но и возможные побочные реакции, связанные с фармакологическим эффектом. Действие исследуемого препарата на больной и здоровый организмы может различаться, поэтому фармакологические испытания должны проводиться на моделях соответствующих заболеваний или патологических состояний.

При токсикологических исследованиях устанавливают характер и выраженность возможного повреждающего действия препаратов на экспериментальных животных. В токсикологических исследованиях выделяют три этапа:

изучение острой токсичности вещества при однократном введении;

определение хронической токсичности соединения, которое включает в себя повторное применение препарата на протяжении 1 года, а иногда и более;

установление специфической токсичности препарата – онкогенности, мутагенности, эмбриотоксичности, включая тератогенное действие, сенсибилизирующих свойств, а также способности вызывать лекарственную зависимость.

Изучение повреждающего действия исследуемого препарата на организм экспериментальных животных позволяет определить, какие органы и ткани наиболее чувствительны к данному веществу и на что следует обратить особое внимание при клинических исследованиях.

Цель клинических исследований - оценка терапевтической или профилактической эффективности и переносимости нового фармакологического средства, установление наиболее рациональных доз и схем его применения, а также сравнительная характеристика с уже существующими лекарственными средствами. При оценке результатов клинических исследований следует учитывать следующие их характеристики: наличие контрольной группы, ясные критерии включения и исключения пациентов, включение пациентов в исследования до выбора лечения, случайный (слепой) выбор лечения, адекватный метод рандомизации, слепой контроль, слепая оценка результатов лечения, информация об осложнениях и побочных эффектах, информация о качестве жизни пациентов, информация о числе больных выбывших из исследования, адекватный статистический анализ с указанием названий использованных текстов и программ, статистическая сила, информация о размере выявленного эффекта.

Программы клинических исследований разных групп препаратов могут значительно различаться. Однако некоторые значительные положения должны быть всегда отражены. Четко следует сформулировать цели и задачи испытания; определить критерии отбора больных; указать метод распределения больных на основную и контрольную группы и число больных в каждой группе; метод установления эффективных доз препарата, длительность исследования; метод контроля (открытый, слепой, двойной и др.), препарат сравнения и плацебо, методы количественного анализа действия исследуемых препаратов (подлежащие регистрации показатели); методы статической обработки данных.

При оценке публикаций, посвященных методам лечения, следует помнить, что критерии исключения больных из исследования указываются достаточно часто, а критерии включения – реже. Если не ясно, на каких пациентах изучался препарат, то трудно оценить информативность полученных данных. Большая часть исследований проводиться в специализированных университетских больницах или научных центрах, где больные, конечно же, отличаются от больных в районных поликлиниках. Поэтому после первичных испытаний проводят все новые и новые исследования. Сначала – многоцентровые, когда благодаря привлечению разных больниц и амбулаторной особенности каждой из них сглаживаются. Затем – открытые. С каждым этапом уверенность в том, что результаты исследований будут применимы для любого стационара, увеличиваются.

Весьма важным и сложным является вопрос об установлении дозы и режима применения исследуемого препарата. Существуют только самые общие рекомендации, в основном сводящиеся к тому, что следует начинать с низкой дозы, которую постепенно увеличивают, пока не будет получен желаемый или побочный эффект. При разработке рациональных доз и схем применения исследуемого препарата, желательно установить широту его терапевтического действия, диапазон между минимальной и максимальной безопасной терапевтическими дозами. Длительность применения исследуемого препарата не должна превышать длительность токсикологических испытаний на животных.

В процессе клинических исследований новых лекарственных средств выделяют 4 взаимосвязанные фазы (этапы).

Фазу первых клинических испытаний называют “пристрелочной”, или “клинико-фармакологической”. Цель ее - установить переносимость исследуемого препарата и наличие у него терапевтического действия.

В фазу II клинические исследования проводят на 100-200 больных. Необходимое условие – наличие контрольной группы, существенно не отличающейся по составу и численности от основной группы. Больные опытной группы (основной) и контрольной, должны быть одинаковыми по полу, возрасту, исходному фоновому лечению (его желательно прекратить за 2-4 недели до начала исследования). Группы формируются случайным образом путем использования таблиц случайных чисел, в которых каждая цифра или каждая комбинация цифр имеет равную вероятность отбора. Рандомизация, или случайное распределение, - основной способ обеспечения сопоставимости групп сравнения.

В клинических исследованиях новые препараты стараются сравнивать с плацебо, что позволяет оценить реальную эффективность терапии, например, ее влияние на продолжительность жизни больных по сравнению с отсутствием лечения. Необходимость двойного слепого метода определяется тем, что если врачи знают, какое лечение получает больной (активный препарат или плацебо), то они могут непроизвольно выдать желаемое за действительное.

Необходимым условием проведения адекватных клинических исследований является рандомизация. Из рассмотрения нужно сразу исключать статьи об исследованиях, в которых распределение пациентов на группы сравнения было не неслучайным, или метод распределения был неудовлетворительным (например, делили пациентов по дням недели поступления в стационар) или вообще отсутствует информация о нем. Еще менее информативными являются исследования с историческим контролем (когда для сравнения используются полученные ранее данные или результаты исследований, проводившихся в других лечебных учреждениях). В международной литературе о рандомизации сообщается в 9/10 статей, посвященным проблемам фармакотерапии, но только в 1/3 статей уточняется метод рандомизации. Если качество рандомизации вызывает сомнение, то опытная и контрольная группы, вероятнее всего, не сравнимы, и необходимо искать другие источники информации.

Большое значение имеет клиническая значимость и статистическая достоверность результатов лечения. Результаты клинического испытания или популяционного исследования представляются в виде сведений о частоте исходов и статистической достоверности различий между группами пациентов. Не представляет ли автор статистически достоверные, но малые различия как клинически значимые? Статистически значимо то, что действительно существует с высокой вероятностью. Клинически значимо то, что своими размерами (например, величиной снижения смертности) убеждает врача в необходимости изменить свою практику в пользу нового метода лечения.

Методы, критерии оценки эффективности препарата, время измерения соответствующих показателей должны быть согласованы перед началом испытания. Критерии оценки бывают клиническими, лабораторными, морфологическими и инструментальными. Нередко об эффективности исследуемого препарата судят по уменьшению дозы других лекарственных средств. Для каждой группы препаратов существуют обязательные и дополнительные (факультативные) критерии.

Целью фазы III клинических испытаний является получение дополнительных сведений об эффективности и побочном действии фармакологического средства, уточняются особенности действия препарата и определяются относительно редко встречающиеся нежелательные реакции. Изучаются особенности препарата у больных с нарушением кровообращения, функции почек и печени, оценивается взаимодействие с другими средствами. Результаты лечения заносятся в индивидуальные регистрационные карты. В конце исследования полученные результаты суммируются, обрабатываются статистически и оформляются в виде отчета. Соответствующие показатели, полученные за один и тот же период времени в основной и контрольной группах, сопоставляются статически. Для каждого показателя вычисляется средняя разность за изучаемый промежуток времени (по сравнению с исходным уровнем до лечения) и оценивается достоверность отмечено динамики внутри каждой группы. Затем сравниваются средние разности величин конкретных показателей контрольной и опытной групп, для оценки различия в действии исследуемого средства и плацебо или препарата сравнения. Отчет о результатах клинических испытаний нового лекарственного средства оформляется в соответствии с требованиями Фармакологического комитета и представляется в комитет с конкретными рекомендациями. Рекомендация к клиническому применению считается обоснованной, если новый препарат:

Более эффективен, чем известные препараты аналогичного действия;

Обладает лучшей переносимостью, чем известные препараты (при одинаковой переносимости);

Эффективен в тех случаях, когда лечение известными препаратами безуспешно;

Более выгоден экономически, имеет простую методику лечения или более удобную лекарственную форму;

При комбинированной терапии повышает эффективность уже существующих лекарственных средств, не увеличивая их токсичности.

После разрешения применения нового препарата в ветеринарной практике и его внедрения начинается фаза IV исследований – действие лекарственного средства изучается в разнообразных ситуациях на практике.

Как известно, проведение фармакопейного анализа ставит своей целью установление подлинности, определение чистоты и количественную оценку действующего вещества или ингредиентов сложной ЛФ. Несмотря на то, что каждый из этих этапов фармакопейного анализа решает свою конкретную задачу, их нельзя рассматривать изолированно. Так выполнение реакции подлинности иногда дает ответ на наличие или отсутствие той или иной примеси. В препарате ПАС-Nа проведение качественной реакции с раствором хлорида железа (III) (как производное салициловой кислоты образует фиолетово-красное окрашивание). А вот появление через три часа осадка в этом растворе свидетельствует о наличии примеси 5-аминосалициловой кислоты, фармакологически не активной. Однако такие примеры довольно редки.

Определение же некоторых констант – температуры плавления, плотности, удельного показателя поглощения, позволяет одновременно сделать вывод и о подлинности и о чистоте данного вещества. Так как методики определения тех или иных констант для различных препаратов идентичны, мы изучаем их в общих методах анализа. Знание теоретических основ и умение провести определение потребуется вам в последующем анализе различных групп препаратов.

Фармакопейный анализ является составной частью фармацевтического анализа и представляет собой совокупность способов исследования лекарственных средств и лекарственных форм, изложенных в Государственной фармакопее и другой НД (ФС, ФСП, ГОСТ) и используемых для определения подлинности, чистоты и количественного анализа.

В контроле качества лекарственных средств используют физические, физико-химические, химические и биологические методы анализа. Испытания по НД включают несколько основных стадий:

описание;

растворимость;

подлинность;

физические константы (температура плавления, кипения или перегонки, показатель преломления, удельное вращение, плотность, спектральные характеристики);

прозрачность и цветность растворов;

кислотность или щёлочность, рН раствора;

определение примесей;

потеря в массе при высушивании;

сульфатная зола;

количественное определение.

В зависимости от природы лекарственного средства некоторые из этих испытаний могут либо отсутствовать, либо включены другие, например, кислотное число, йодное число, число омыления и др.

Частная фармакопейная статья на любой препарат начинается разделом «Описание», в котором в основном приводится характеристика физических свойств вещества:

агрегатного состояния (твердое вещество, жидкость, газ), если твердое вещество, то определяется степень его дисперсности (мелкокристаллический, крупнокристаллический), форма кристаллов (игольчатые, цилиндрические)

цвет вещества – важный показатель подлинности и чистоты. Большинство ЛС не имеют окраски, то есть являются белыми. Окраску визуально при определении агрегатного состояния. Небольшое количество вещества помещают тонким слоем на чашку Петри или часовое стекло и рассматривают на белом фоне. В ГФ Х1 имеется статья «Определение степени белизны порошкообразных ЛС». Определение проводится инструментальным методом на специальных фотометрах «Specol-10». Оно основано на спектральной характеристике света, отраженного от образца ЛВ. Измеряют так называемыйкоэффициент отражения – отношение величины отраженного светового потока к величине падающего. Измеренные коэффициенты отражения позволяют определить наличие или отсутствие у веществ цветового или сероватого оттенка путем расчета степени белизны (α) и степени яркости (β). Так как появление оттенков или изменение цвета является, как правило, следствием химических процессов – окисления, восстановления, то уже этот начальный этап исследования веществ позволяет сделать выводы. Этот метод исключен из ГФ Х11 издания.

Запах определяют редко сразу после вскрытия упаковки на расстоянии 4-6 см. Отсутствие запаха после вскрытия упаковки сразу по методике : 1-2 г вещества равномерно распределяют на часовом стекле диаметром 6-8 см и через 2 мин определяют запах на расстоянии 4-6 см.

В разделе «Описание» могут быть указания на возможность изменения веществ в процессе хранения . Например, в препарате кальция хлорид указано, что он очень гигроскопичен и расплывается на воздухе, а натрия йодид – на воздухе сыреет и разлагается с выделением йода, кристаллогидраты, в случае выветривания или несоблюдения условий кристаллизации в производстве, уже не будут иметь нужный внешний вид ни по форме кристаллов, ни по цвету.

Таким образом исследование внешнего вида вещества является первым, но очень важным этапом в анализе веществ и необходимо уметь связать изменения внешнего вида с возможными химическими изменениями и сделать правильный вывод.

Растворимость (ГФ XI, вып. 1, с. 175, ГФ XII, вып. 1, с. 92)

Растворимость является важным показателем качества лекарственного вещества. Как правило, в НД приводится некоторый перечень растворителей, наиболее полно характеризующий это физическое свойство с тем, чтобы в дальнейшем оно могло быть использовано для оценки качества на том или ином этапе исследования этого лекарственного вещества. Так, растворимость в кислотах и щелочах характерна для амфотерных соединений (цинка оксид, сульфаниламиды), для органических кислот и оснований (кислоты глютаминовая, ацетилсалициловая, кодеин). Изменение растворимости указывает на присутствие или появление при хранении менее растворимых примесей, что характеризует изменение его качества.

В ГФ XI под растворимостью подразумевают не физическую константу, а свойство, выраженное приблизительными данными и служащее для ориентировочной характеристики препаратов.

Наряду с температурой плавления растворимость вещества при постоянной температуре и давлении является одним из параметров , по которому устанавливают подлинность и чистоту (доброкачественность) практически всех лекарственных средств.

Рекомендуется использовать растворители разной полярности (обычно три); не рекомендуется использование легкокипящих и легковоспламеняющихся (диэтиловый эфир) или очень токсичных (бензол, метиленхлорид) растворителей.

Фармакопеей XI изд. приняты два способа выражения растворимости :

В частях (соотношение вещества и растворителя) . Например, для натрия хлорида по ФС растворимость в воде выражена в соотношении 1:3, это означает, что для растворения 1 г лекарственного вещества необходимо не более 3 мл воды.

В условных терминах (ГФ XI, с.176). Например, для натрия салицилата в ФС дана растворимость в условных терминах – «очень легко растворим в воде». Это означает, что для растворения 1 г вещества необходимо до 1 мл воды.

Фармакопеей XII изд.только в условных (в пересчете на 1 г)

Условные термины и их значения приведены в табл. 1. (ГФ XI, вып. 1, с. 176, ГФ XII, вып. 1, с. 92).

Условные термины растворимости

Условный термин соответствует определённому интервалу объёмов растворителя (мл), в пределах которого должно происходить полное растворение одного грамма лекарственного вещества.

Процесс растворения осуществляют в растворителях при температуре 20°С . С целью экономии лекарственного вещества и растворителя массу препарата отвешивают с таким расчётом (с точностью до 0,01 г), чтобы на установление растворимости воды расходовалось не более 100 мл, а органических растворителей - не более 10-20 мл.

Лекарственное вещество (субстанцию) считают растворимым , если в растворе при наблюдении в проходящем свете не обнаруживаются частицы вещества.

Методика . (1 способ). Отвешенную массу лекарственного средства, предварительно растёртого в тонкий порошок, вносят в отмеренный объём растворителя, соответствующий минимальному его объёму, встряхивают. Затем в соответствии с табл. 1 добавляют постепенно растворитель до максимального его объёма и непрерывно встряхивают в течение 10 мин. По истечений этого времени в растворе невооружённым глазом не должны обнаруживаться частицы вещества. Например, отвешивают 1 г натрия бензоата, помещают в пробирку с 1 мл воды, взбалтывают и постепенно приливают 9 мл воды, т.к. натрия бензоат легко растворим в воде (от 1 до 10 мл).

Для медленно растворимых лекарственных средств, требующих для полного растворения более 10 мин., допускается нагревание на водяной бане до 30°С. Наблюдение проводят после охлаждения раствора до 20°С и энергичного встряхивания в течение 1-2 мин. Например, кофеин медленно растворим в воде (1:60), кодеин медленно и мало растворим в воде (100-1000), кальция глюконат медленно растворим в 50 ч. воды, кальция лактат медленно растворим в воде, кислота борная медленно растворима в 7 ч. глицерина.

2 способ. Растворимость, выраженная в частях, показывает объём растворителя в мл, необходимого для растворения 1 г вещества.

Методика . (2 способ) Взвешенную на ручных весах массу лекарственного средства растворяют в указанном НД объёме растворителя. В растворе не должны обнаруживаться частицы не растворившегося вещества.

Растворимость в частях указывается в фармакопейных статьях для следующих препаратов: кислота борная (растворим в 25 ч. воды, в 25 ч. спирта, в 4 ч. кипящей воды);калия иодид (растворим в 0,75 ч. воды, в 12 ч. спирта и в 2,5 ч. глицерина);натрия бромид (растворим в 1,5 ч. воды, в 10 ч. спирта);калия бромид (растворим в 1,7 ч. воды и м.р. спирте);калия хлорид и натрия хлорид (р. в 3 ч. воды).

В случае испытания, например, натрия бромида поступают так: отвешивают на ручных весочках 1 г натрия бромида, добавляют 1,5 мл воды и взбалтывают до полного растворения.

Общая фармакопейная статья «Растворимость » ГФ XII изд.дополнена описанием методик определения растворимости веществ с неизвестной и известной растворимостью.

Температура плавления (Т °пл)

Температура плавления является константой, характеризующей чистоту вещества и одновременно его подлинность . Из физики известно, что температура плавления – это температура, при которой твердая фаза вещества находится в равновесии с расплавом. Чистое вещество имеет четкую температуру плавления. Поскольку ЛВ могут иметь незначительное количество примесей, такой четкой картины мы уже не увидим. В этом случае определяется интервал, при котором плавится вещество. Обычно этот интервал лежит в пределах 2 ◦ С. Более растянутый интервал свидетельствует о наличии примесей в недопустимых пределах.

Согласно формулировке ГФ Х1 под температурой плавления вещества понимают интервал температуры между началом плавления (появлением первой капли жидкости) и концом плавления (полным переходом вещества в жидкое состояние).

Если вещество имеет нечеткое начало или конец плавления , определяют температуру только начала или конца плавления . Иногда вещество плавится с разложением, в этом случае определяют температуру разложения , то есть температуру, при которой происходит резкое изменение вещества (например, вспенивание).

Методы определения температуры плавления

Выбор метода диктуется двумя моментами:

устойчивостью вещества при нагревании и

способностью растираться в порошок.

Согласно ГФ Х1 издания, существует 4 способа определения Т °пл:

Метод 1 – для веществ, способных растираться в порошок, устойчивых при нагревании

Метод 1а – для веществ, способных растираться в порошок, не устойчивых при нагревании

Методы 2 и 3 – для веществ, не растирающихся в порошок

Методы 1, 1а и 2 предполагают использование 2х приборов:

ПТП (прибор для определения Тпл ): знаком Вам с курса органической химии, позволяет определить Тпл веществ в пределах от 20 ◦ С до 360 ◦ С

Прибор, состоящий из круглодонной колбы с впаянной в нее пробиркой, в которую вставляется термометр с прикрепленным к нему капилляром, содержащим исходное вещество . Во внешнюю колбу залита на ¾ объема жидкость-теплоноситель:

вода (позволяет определить Тпл до 80 ◦ С),

вазелиновое масло или жидкие силиконы, концентрированная серная кислота (позволяет определить Тпл до 260 ◦ С),

смесь серной кислоты и сульфата калия в соотношении 7:3 (позволяет определить Тпл выше 260 ◦ С)

Методика общая независимо от прибора.

Тонко измельченное сухое вещество помещают в капилляр средних размеров (6-8 см) и вносят в прибор при температуре на 10 градусов ниже ожидаемой. Отрегулировав скорость подъема температуры, фиксируют температурный интервал изменений вещества в капилляре При этом проводят не менее 2х определений и берут среднее арифметическое.

Тпл определяют не только у чистых веществ, но и у их производных – оксимов, гидразонов, оснований и кислот, выделенных из их солей.

В отличие от ГФ XI в ГФ XII изд. температура плавления в капиллярном методе означает не интервал между началом и концом плавления, а температуру конца плавления , что согласуется с Европейской фармакопеей.

Температурные пределы перегонки (Т ° кип.)

ГФ величина определяется как интервал между начальной и конечной температурой кипения при нормальном давлении. (101,3 кПа – 760 мм рт.ст.). Интервал обычно составляет 2°.

Под начальной Т°кип. понимают температуру, при которой в приемник перегнались первые пять капель жидкости.

Под конечной – температуру, при которой в приемник перешло 95% жидкости.

Более растянутый интервал, чем указано в соответствующей ФС, свидетельствует о наличие примесей.

Прибор для определения ТПП состоит из

термостойкой колбы с термометром, в которую помещают жидкость,

холодильника и

приемной колбы (градуированного цилиндра).

ТПП, наблюдаемые в опыте, приводят к нормальному давлению по формуле:

Тиспр = Тнабл + К· (р – р 1)

Где: р – нормальное барометрическое давление (760 мм рт ст)

р 1 – барометрическое давление во время опыта

К – прирост Ткип на 1мм давления

Таким образом определяя температурные пределы перегонки определяют подлинность и чистоту эфира, этанола, хлорэтила, фторотана.

ОФС ГФ XII «Определение температурных пределов перегонки » дополнена определением точки кипения и в частных ФС рекомендует определять температуру затвердевания или кипения для жидких ЛВ.

Плотность (ГФ XI, вып. 1, с. 24)

Плотность – это масса единицы объема вещества. Выражается в г/см 3 .

ρ = m / V

Если массу измерить в гр, а объем в см 3 , то плотность – это масса 1 см 3 вещества.

Определение плотности проводят с помощью пикнометра (до 0,001). или ареометра (точность измерения до 0,01)

Устройство приборов смотрите в ГФ Х1 издании.

Фармацевтический анализ (ФА). Он является основой фармацевтической химии и имеет свои особенности, отличающие его от других видов анализа. Они заключаются в том, что анализу подвергаются вещества различной химической природы: неорганические, элементоорганические, радиоактивные, органические соединения от простых алифатических до сложных природных БАВ. Чрезвычайно широк диапазон концентраций анализируемых веществ. Объектами фармацевтического анализа являются не только индивидуальные лекарственные вещества, но и смеси, содержащие различное число компонентов.

Ежегодное пополнение арсенала лекарственных средств вызывает необходимость разработки новых способов их анализа. Способы фармацевтического анализа нуждаются в систематическом совершенствовании в связи с непрерывным повышением требований как к качеству лекарственных средств, так и к количественному содержанию в них БАВ. Вот почему к фармацевтическому анализу предъявляют высокие требования. Он должен быть достаточно специфичен и чувствителен, точен по отношению к нормативным требованиям Государственной фармакопеи X и XI и другой НТД (ФС, ГОСТ), выполняться в короткие промежутки времени с использованием минимальных количеств испытуемых препаратов и реактивов.

В зависимости от поставленных задач фармацевтический анализ включает различные формы контроля качества лекарственных средств: фармакопейный анализ; постадийный контроль производства лекарств; анализ лекарственных форм индивидуального изготовления; экспресс-анализ в условиях аптеки и биофармацевтический анализ. Составной его частью является фармакопейный анализ, который представляет собой совокупность способов исследований лекарственных препаратов и лекарственных форм, изложенных в Государственной фармакопее или другой НТД (ФС, ФСП, ГОСТ). На основании результатов, полученных при выполнении фармакопейного анализа, делается заключение о соответствии лекарственного средства требованиям Государственной фармакопеи или другой НТД. При отклонении от этих требований лекарство не допускается к применению.

Химический анализ растительного сырья. По технике выполнения и характеру получаемых результатов химические реакции делят на несколько групп: качественные, микрохимические и гистохимические, микросублимация.

Для установления подлинности лекарственного растительного сырья используют простейшие качественные реакции и хроматографические пробы на действующие и сопутствующие вещества. Методика изложена в соответствующей нормативной документации на исследуемый вид сырья в разделе «Качественные реакции».

Качественные реакции выполняют на сухом сырье с такими видами сырья: кора дуба, калины, крушины, корневища бадана, корневища и корни девясила, корни одуванчика, алтея, женьшеня, барбариса, цветки липы, семена льна, склероции спорыньи (всего для 12 видов сырья).

В основном качественные реакции проводят с извлечением (вытяжкой) из лекарственного растительного сырья.

Исходя из свойств биологически активных веществ, их извлекают из сырья водой, спиртом различной концентрации или органическим растворителем, реже с добавлением щелочи или кислоты.

Водное извлечение готовят из сырья, содержащего гликозиды, полисахариды, сапонины, фенологликозиды, антрагликозиды, дубильные вещества. Подкисленной водой извлекают из сырья алкалоиды в виде солей.

Большую группу биологически активных веществ (сердечные гликозиды, кумарины, лигнаны, флавоноиды) извлекают этиловым и метиловым спиртом различной концентрации.

Если реакция достаточно специфична и чувствительна, то ее проводят с неочищенным экстрактом из сырья.

К таким реакциям относятся:

общеалкалоидные осадочные реакции;

реакции с раствором хлорида алюминия на флавоноиды (трава зверобоя, горца птичьего, горца перечного и др.);

проба Синода на флавоноиды в цветках бессмертника;

реакция с раствором щелочи на антраценпроизводные (кора крушины, корни ревеня и др.);

реакция с раствором железоаммонийных квасцов на дубильные веществ (кора дуба, корневища змеевика, бадана и др.).

Часто проведению реакции мешают сопутствующие вещества (белки, амины, стерины, хлорофилл). В этом случае используют очищенное извлечение (например, из сырья, содержащего сердечные гликозиды, кумарины, алкалоиды, фенологликозиды, лигнаны).

Очищают извлечение осаждением сопутствующих веществ раствором ацетата свинца и сульфата натрия или используют прием смены растворителей либо метод распределительной хроматографии.

Микрохимические реакции проводят обычно одновременно с микроскопическим анализом, наблюдая результаты под микроскопом:

на эфирное и жирное масло с раствором Судан III;

на одревесневшие лигнифицированные элементы с раствором флороглюцина и 25%-ным раствором серной кислоты или концентрированной хлороводородной кислоты.

На кору дуба (порошок) проводят реакцию с железоаммонийными квасцами и результат реакции изучают под микроскопом.

Гистохимические реакции - это такие реакции, с помощью которых можно выявить те или иные соединения непосредственно в клетках или структурах, где они локализуются.

По Государственной фармакопее XI, гистохимические реакции проводят на слизь с раствором туши в корнях алтея и семенах льна.

Микросублимация - непосредственное выделение из сухого растительного материала веществ, которые легко возгоняются при нагревании. Полученный сублимат исследуют под микроскопом, затем проводят микрохимическую реакцию с соответствующим реактивом.

Методы определения подлинности лекарственного растительного сырья. Подлинность сырья определяется макроскопическим, микроскопическим, химическим и люминесцентным анализами.

Макроскопический анализ. Для его проведения следует знать морфологию растений. Изучают внешний вид сырья невооруженным глазом или с помощью лупы, измеряют размеры частиц с помощью миллиметровой линейки. При дневном освещении определяют цвет сырья с поверхности, на изломе и на разрезе. Запах устанавливают при растирании или разломе растений, а вкус - только у неядовитых растений. При изучении внешнего вида обращают внимание на морфологические признаки частей сырья.

Микроскопический анализ. Используют для определения подлинности измельченного лекарственного растительного сырья. Для этого нужно знать анатомическую структуру растений в целом и характерные для конкретного растения признаки, отличающие его от других растений.

Химический анализ. Предусматривает проведение качественных, микрохимических, гистохимических реакций и сублимации для определения в сырье действующих или сопутствующих веществ. Микрохимические реакции целесообразно проводить параллельно с микроскопическим анализом. Гистохимические реакции проводят для выявления конкретных соединений в местах их локализации в растении. Под сублимацией понимают получение из растительного сырья легко возгоняемых при нагревании веществ с последующей качественной реакцией с сублиматом.

Люминесцентный анализ. Это метод исследования различных объектов (в том числе и биологических), основанный на наблюдении их люминесценции. Люминесценция - свечение газа, жидкости или твердого тела, обусловленное не нагревом тела, а нетепловым возбуждением его атомов и молекул. Люминесцентный анализ проводят для определения в лекарственном сырье веществ, обладающих люминесценцией.

Контроль качества органотерапевтических препаратов. Для проверки соответствия качества желез требованиям стандарта от каждой партии отбирают 5 % ящиков или пакетов, но не менее пяти таких упаковок. Если в одном из вскрытых ящиков или пакетов железы не соответствуют требованиям соответствующего стандарта хотя бы по одному из показателей, то проверяют всю партию.

Для единичных видов сырья имеются объективные (лабораторные) методы оценки его качества.

Объективно качество поджелудочной железы, предназначенной для производства инсулина, согласно ГОСТу, определяют по показателям массовой доли жира и массовой доли инсулина с помощью соответствующих лабораторных методов.

Массовую долю жира определяют жиромером. Массовую долю инсулина проверяют по требованию потребителя иммунореактивным методом с помощью антисыворотки, иммуноглобулинов в гомогенизированной железе.

Качество слизистой оболочки (эпителия) языков крупного рогатого скота проверяют путем определения величины pH консервирующей среды с эпителием и ее бактериальной обсемененности. Сущность метода заключается в определении общего количества микробов в 1 мл консервирующей среды с эпителием.

Качество стекловидного тела глаз крупного рогатого скота, свиней, овец и коз замороженного определяют по количественному содержанию гиалуроновой кислоты (по глюкозамину) в стекловидном теле. Принцип метода основан на определении глюкоза-мина в продуктах гидролиза гиалуроновой кислоты, который является составной частью молекулы гиалуроновой кислоты и находится в прямой зависимости от содержания его в стекловидном теле.

Биологическую активность гипофизов определяют в единицах действия АКТГ, содержащегося в 1 мг кислого ацетонированного порошка (КАП), полученного из гипофизов.

Определение активности АКТГ основано на его способности вызывать редукцию лимфоидной ткани, в частности зобной железы крысят. За единицу действия препарата принимают ту ежедневную дозу препарата, которая при введении в течение пяти суток вызывает уменьшение массы железы на 50±5 %.

Качество паращитовидных желез определяют гистологическим методом. На срезах паращитовидных желез просматриваются скопления эпителиальных клеток с выраженной базофильной зернистостью. На срезах лимфатических желез просматривается ретикулярная ткань (в виде однородной массы), окруженная плотной соединительной оболочкой (капсулой), от которой внутрь отходят ясно видимые соединительные тяжи. Государственным стандартом предусмотрено, что в пробе из 40 желез может содержаться не более одного лимфатического узла.

Методы определения качества сухих биологических препаратов. Сухие биологические препараты имеют ряд преимуществ по сравнению с традиционными жидкими биопрепаратами благодаря лучшему качеству, меньшей массе, возросшему сроку хранения, удобству транспортирования.

Физические методы. 1.Метод определения вакуума. Сущность метода заключается в способности высокочастотного электрического тока при большом напряжении вызывать в газах свечение, характер которого изменяется в зависимости от степени разреженности воздуха в ампуле (флаконе).

Отбор проб. Отбор проб проводят в соответствии с правилами, установленными в государственных стандартах на сухие биологические препараты.

Аппаратура и оборудование. При проведении испытания используют: аппарат типа «Д’Арсеналь» или «Тесла», штатив для ампул, стол металлический.

Проведение испытания. Подготовка к испытанию:

перед испытанием проверяют внешний вид, плотность укупоривания флаконов, наличие трещин, запайку ампул.

Аппарат выдерживают в течение 10 мин после включения. Испытуемые ампулы устанавливают в штативе, затем к ним подводят электрод на расстояние 1 см. При определении вакуума с помощью аппарата «Тесла» один металлический электрод аппарата заземляют через металлический стол, на котором разложены ампулы, а другой подводят к проверяемым ампулам. Экспозиция не более 1 с.

Обработка результатов. Появление свечения внутри ампул с характерным потрескиванием указывает на наличие в них вакуума.

Степень разрежения воздуха в проверяемых ампулах определяют по характеру свечения газов в проверяемых ампулах в соответствии с нижеследующими данными.

Определение степени разрежения воздуха в проверяемых ампулах

2. Метод определения в л а ж н о с т и. Сущность метода заключается в определении уменьшения массы пробы препарата после ее высушивания в течение 1 ч при температуре 105 °С.

Отбор проб. Для испытания из разных мест упаковки отбирают необходимое количество ампул (флаконов) с учетом требований к массе проб (в соответствии со стандартом).

При отборе проб проверяют герметичность ампул. У флаконов с лиофилизированным препаратом проверяют стенку и дно на целостность, а также полноту прилегания закатанного колпачка и резиновой пробки. При наличии дефектов флакон заменяют другим. Каждую ампулу, запаянную под вакуумом, перед извлечением из нее препарата проверяют на герметичность.

Аппаратура, материалы и реактивы. При проведении испытания используют: весы лабораторные, шкаф сушильный лабораторный, термометры ртутные, эксикатор, бюксы стеклянные, вазелин технический, кальций хлористый безводный или гипс обезвоженный, или силикагель прокаленный.

Подготовка к испытанию. Сушильный шкаф проверяют максимальными термометрами на равномерность нагрева.

При высушивании проб в бюксах нижняя часть контрольного термометра должна находиться на уровне бюкс. Показания контрольного термометра являются определяющими для настройки температуры в шкафу.

Весы должны быть установлены на прочном столе без вибрации. Результаты всех взвешиваний регистрируют в граммах с точностью до четвертого десятичного знака.

Нижняя часть эксикатора должна быть заполнена обезвоженным хлористым кальцием или гипсом, или силикагелем. Пришлифованные края сосуда слегка смазывают техническим вазелином.

Для каждого анализа должны быть подготовлены три бюксы одинаковых диаметров и высоты.

Проведение испытания. Для определения влажности используют три ампулы, если в каждой из них масса пробы не менее 0,1 г. Если ампула содержит менее 0,1 г биологического препарата, то можно использовать две и более ампул.

Отобранную пробу, растолченную до порошкообразного состояния, помещают ровным слоем в предварительно взвешенную бюксу.

Бюксы устанавливают в сушильный шкаф на полку. Началом сушки следует считать время достижения температуры 105 °С по контрольному термометру. Продолжительность сушки 60 мин.

После окончания сушки бюксы быстро закрывают крышками и переносят в эксикатор для охлаждения до комнатной температуры, после чего бюксы взвешивают с точностью до четвертого знака и регистрируют по форме.

3. Метод определения количества кислорода. Отбор проб. Отбор проб проводят в соответствии с правилами, установленными в государственных стандартах на сухие биологические препараты.

Аппаратура, материалы и реактивы. При проведении испытания используют: хроматограф газовый марки ЛXM-8МД или других аналогичных марок с детектором по теплопроводимости и газохромографической колонкой диаметром 3 мм и длиной 1000 мм, печь муфельную с температурой нагрева до 1000 °С, измеритель расхода газа с бюреткой, секундомер, шприц медицинский вместимостью 1 см 3 , сетки проволочные тканые, лупу измерительную, эксикатор, ступку фарфоровую, линейку металлическую длиной 30 см, сита молекулярные - цеолит синтетический марки СаА, иглу медицинскую, трубку медицинскую резиновую внутренним диаметром 4,2 мм, длиной 10 м, бутыль вместимостью 3000 см 3 , пробку резиновую, масло силиконовое, гелий, азот газообразный, воду дистиллированную.

Подготовка к испытанию. Подготовка колонки. Синтетический цеолит измельчают в фарфоровой ступке, отсеивают на ситах, промывают дистиллированной водой, высушивают и прокаливают в муфельной печи при температуре 450...500 °С в течение 2 ч, затем охлаждают в эксикаторе на сетках до комнатной температуры.

Хроматографическую колонку устанавливают вертикально и засыпают синтетическим цеолитом. Колонку не досыпают на 1 см и закупоривают сеткой. Заполненную колонку устанавливают в термостате хроматографа и, не присоединяя к детектору, пропускают через нее поток гелия или азота в течение 3 ч при температуре 160... 180 °С. Затем колонку присоединяют к детектору и продолжают через нее пропускать гелий или азот, пока не прекратится дрейф нулевой линии при максимальной чувствительности детектора.

Подготовку хроматографа к работе и включение выполняют в соответствии с заводской инструкцией.

Подготовка флакона с препаратом к испытанию. Для отбора пробы из флакона с препаратом выравнивают давление газа во флаконе с атмосферным давлением.

Подготовка медицинского шприца. Предварительно устанавливают на штоке шприца металлическую трубку и проверяют шприц на герметичность. Проверенным и подготовленным к отбору газа медицинским шприцем с иглой прокалывают резиновую трубку, по которой выходит гелий из колонки сравнения хроматографа, и дважды медленно шприцем набирают и выпускают гелий. В третий раз, набрав гелий в шприц и расположив его иглой вниз, отбирают пробы газа из флакона с препаратом.

Проведение испытания. Из каждого флакона отбирают две пробы газа и последовательно одну за другой с интервалом 3...4 мин вводят в испаритель хроматографа. Пробу в испаритель вводят плавным нажатием пальца на шток. Через 110... 120 с после ввода пробы на хроматограмме самописец вычерчивает пик кислорода, а затем пик азота.

Обработка результатов. Рассчитывают площадь пиков кислорода и азота. Для этого на хроматографе измеряют высоту и ширину пиков кислорода и азота с помощью металлической линейки длиной 30 см, увеличительной лупы и остро заточенного карандаша. Высоту пиков измеряют от базовой линии до вершины пика, ширину пика - на половине его высоты. При измерениях берут расстояние от внутренней толщины линии пика до наружной.

Площадь пиков кислорода (SО 2 , мм 2) и азота (5N 2 , мм 2) вычисляют по формулам

SО 2 = h 1 *b 1 ; SN = h 2 *b 2 ,

где h 1 h 2 ~ высота пиков кислорода и азота, мм; b 1 , b 2 - ширина пиков кислорода и азота, мм.

Объемную долю кислорода (X, %) в каждой пробе газа вычисляют по формуле

X=SO 2 /(SO 2 +SN 2)

где SO 2 , SN 2 - площади пиков кислорода и азота, мм 2 .

За окончательный результат испытания принимают среднее арифметическое результатов определений в трех флаконах препарата.

Относительная приведенная погрешность метода при доверительной вероятности Р- 0,95 не должна превышать 10 %.

Бактериологический метод. Контроль стерильности. Сущность метода заключается в микробиологической оценке отсутствия роста бактерий и грибов в высевах препаратов на питательные среды.

Отбор проб. От каждой серии препаратов отбирают пробы в количестве 0,15 % флаконов, но не менее пяти для жидких и 10 ампул для сухих препаратов.

Подготовка к испытанию. Лабораторную посуду кипятят в течение 15 мин в дистиллированной воде, подкисленной раствором соляной кислоты, а затем промывают водопроводной водой и моют ершом в растворе, содержащем на 1000 см 3 дистиллированной воды 30 г стирального порошка и 50 см 3 водного аммиака. После этого посуду тщательно промывают сначала водопроводной водой, а затем три раза дистиллированной водой, высушивают и стерилизуют.

Перед стерилизацией посуду укладывают в металлические пеналы. Стерилизуют посуду в автоклаве при 0,15 МПа в течение 60 минут.

Готовые питательные среды, проверенные на ростовые свойства, разливают по 6...8 см 3 (для определения анаэробов по 10...12 см 3) в пробирки, по 50...60 см 3 во флаконы вместимостью 100 см 3 .

Пробы сухих биологических препаратов предварительно растворяют стерильным растворителем (изотонический раствор хлорида натрия, дистиллированная вода и т. д.).

Проведение испытания. 1. Проведение испытания на стерильность с использованием тиогликолевой среды.

Из каждого флакона препарата производят посев по 1 см 3 в три пробирки, содержащие тиогликолевую среду.

Две засеянные пробирки выдерживают в термостате в течение 14сут: одну -при температуре 21 °С, другую -при температуре 37 °С.

Третью пробирку выдерживают в течение 7 сут при температуре 37 °С и затем делают из нее пересевы по 0,5 см 3 по одной пробирке на скошенный казеиновый агар, казеиновый питательный бульон, среду Сабуро и по 1 см 3 на казеиновый питательный бульон под вазелиновым маслом с кусочками мяса или печени.

Пересевы на казеиновый агар, мясопептонный бульон выдерживают еще в течение 7 сут при температуре 37 °С, а пересев на среду Сабуро - при температуре 21 °С.

При испытании проб препаратов проводят контроль стерильности сред: три пробирки с каждой средой выдерживают в термостате в течение 14 сут при 37 °С, со средой Сабуро - при температуре 21 °С.

2. Проведение испытания на стерильность без тиогликолевой среды.

Из каждой пробы препарата производят посев на жидкую среду Сабуро, мясопептонный агар и мясопептонный бульон - по три пробирки; на среду Тароцци - по две пробирки и два флакона.

Для выявления аэробов высевают 0,5 см 3 посевного материала в одну пробирку и 1...2 см 3 в один флакон, а для выявления анаэробов - соответственно по 1 и 5 см 3 . Посевы помещают в термостат (при температуре 37 °С; для Сабуро - при температуре 21 °С) на 7 сут (15 сут для анаэробов). Затем делают пересев (кроме посевов на мясопептонном агаре). Пересевают на те же среды. Выдерживают 7 сут (15 сут для анаэробов). Проводят контроль стерильности.

Оценка результатов. Учитывают результаты первичного и повторного посевов путем макроскопического, а в случае роста микроорганизмов - микроскопического исследования всех посевов, учитывают через 14 сут после первичного посева на тиогликолевой среде и через 7 сут после первичного посева без тиогликолевой среды. Среду считают стерильной, если ни в одной из засеянных пробирок не наблюдается рост.

В случаях роста хотя бы в одной из засеянных пробирок контроль стерильности повторяют на том же количестве проб и проводят микроскопию выросших микробов. Мазки окрашивают по Граму, отмечая морфологию.

При отсутствии роста в повторном контроле препарат считают стерильным. При наличии роста хотя бы в одной из пробирок и идентичности микрофлоры при первичном и повторном посевах препарат считают нестерильным.

Если при первичном и повторном посевах выявлена различная микрофлора, а также выявлен рост лишь в отдельных пробирках, проводят посев образцов в третий раз.

При отсутствии роста препарат считают стерильным. При обнаружении роста хотя бы в одной пробирке независимо от характера микрофлоры препарат считают нестерильным.

Нормативные требования к качеству готовых лекарственных форм. Лекарственные формы изготовляют на заводах, фармацевтических фабриках (официальные лекарственные средства) и в аптеках (магистральные лекарственные средства). Контроль готовых лекарственных форм на фармацевтических предприятиях осуществляют в соответствии с требованиями НТД (Государственной фармакопеи, ФС, ФСП, ГОСТов). В соответствии с требованиями этих документов лекарственные формы должны подвергаться проверке (В. Д. Соколов, 2003).

Таблетки испытывают на распадаемость. Если нет других указаний в частной статье, то таблетки должны распадаться в течение 15 мин, а покрытые оболочкой не более 30 мин. Кишечнорастворимые таблетки не должны распадаться в течение 1 ч в растворе соляной кислоты, но должны распадаться в течение 1 ч в растворе натрия гидрокарбоната. Прочность таблеток на истирание должна быть не менее 75 %. Лекарственное средство, содержащееся в таблетке, должно растворяться в воде за 45 мин не менее чем на 75 %. Среднюю массу определяют взвешиванием 20 таблеток с точностью до 0,001 г. Допускаются отклонения от средней массы: ±7,5%-для таблеток массой 0,1...0,3 г и ±5%-для таблеток массой 0,5 г и более. В таблетках также контролируют содержание талька.

Гранулы - определяют размер с помощью ситового анализа. Диаметр ячейки должен быть 0,2...3 мм, а число более мелких и более крупных гранул не должно превышать 5 %. Испытание распадаемости гранул из навески 0,5 г такое же, как и у таблеток. Время распадаемости не должно превышать 15 мин. Определяют влагу. Для выявления содержания лекарственного вещества берут навеску не менее чем из 10 растертых гранул.

Капсулы - контролируют среднюю массу. Отклонение от нее каждой капсулы не должно превышать ±10 %. Подобно тому как это проводят с таблетками, контролируют распадаемость и растворимость, а также определяют однородность дозирования для капсул, содержащих 0,05 г и менее лекарственного вещества. Количественное определение лекарственных веществ выполняют по специальным методикам, используя для этих целей содержимое от 20 до 60 капсул.

Порошки - устанавливают отклонения в массе дозированных порошков. Они могут быть ±15% при массе порошка до 0,1 г; ±10 % - от 0,1 до 0,3 г; ±5 % - от 0,3 до 1; ±3 % - свыше 1 г.

Суппозитории - визуально определяют однородность на продольном разрезе. Среднюю массу устанавливают взвешиванием с точностью до 0,01 г, отклонения не должны превышать ± 5 %. Суппозитории, изготовленные на липофильных основаниях, контролируют по температуре плавления. Она не должна превышать

37 °С. Если эту температуру установить невозможно, то определяют время полной деформации, которое должно быть не более 15 мин. Суппозитории, изготовленные на гидрофильной основе, испытывают на растворимость (показатель «растворение»). Определяют время растворения при температуре (37±1) °С, которое не должно превышать 1 ч. Количественное определение лекарственных веществ проводят по специальным методикам.

Настойки - определяют содержание спирта или плотность. Содержание действующих веществ устанавливают с помощью специальных методик. Кроме того, определяют сухой остаток после выпаривания в бюксе 5 мл настойки досуха и высушивания его в течение 2 ч при температуре (102,5±2,5) °С. В таком же объеме настойки после сжигания и прокаливания ее смеси с 1 мл концентрированной серной кислоты определяют содержание тяжелых металлов.

Экстракты - как и в настойках, определяют плотность или содержание спирта, действующих веществ, тяжелых металлов. Устанавливают также сухую массу остатка, а в густых и сухих экстрактах - содержание влаги [высушиванием в сушильном шкафу при температуре (102,5±2,5) °С).

Аэрозоли - измеряют давление внутри баллона с помощью манометра при комнатной температуре (если пропеллентом служит сжатый газ). Проверяют упаковку на герметичность. В дозированных упаковках определяют среднюю массу препарата в одной дозе, отклонение в которой допускается не более +20 %. Устанавливают процент выхода содержимого путем удаления его из баллона с последующим взвешиванием. Количественное определение вещества проводят в соответствии с требованиями частных статей Государственной фармакопеи. Отклонения от изложенных количеств не должно превышать ±15 %.

Мази - общим испытанием является метод определения размера частиц лекарственного вещества в мазях. Используют микроскоп с окулярным микрометром МОВ-1.

Пластыри. Состав, показатели качества, методики испытаний бывают разные и изложены в нормативной документации на конкретную продукцию.

Капли глазные испытывают на стерильность и наличие механических включений.

Инъекционные лекарственные формы. Особого внимания требуют инъекционные лекарственные растворы, вводимые внутривенно в больших количествах. Используют такие характеристики, как внешний вид, в том числе окраска и прозрачность растворов, отсутствие механических примесей, апирогенность, стерильность, объем раствора, количество в нем действующего вещества, pH и изотоничность плазмы крови, упаковка, маркировка, объем наполнения ампул. Нормы допустимых отклонений указаны в Государственной фармакопее XI. Кроме того, определяют содержание вспомогательных веществ; для некоторых из них (фенол, крезол, сульфиты, хлорбутанол) предусмотрены допустимые количества (от 0,2 до 0,5 %). Требования к pH зависят от препарата, обычно его показатель может находиться в пределах от 3,0 до 8,0. На каждой ампуле (флаконе) указывают название лекарственного средства, его содержание (в процентах) или активность (в единицах действия, ЕД), объем или его массу, номер серии, срок годности. Проведение всех испытаний инъекционных лекарственных форм регламентировано НТД.

Анализ гомеопатических лекарственных средств весьма труден из-за высоких разведений лекарственных веществ. Если БАВ содержатся в настойках, эссенциях, мазях и других формах в разведениях до 2 С (С - сотенное) или 0,0001, то их анализ и стандартизация практически не отличаются от контроля качества лекарственных форм, используемых в аллопатической медицине. Лекарственные средства в разведении 2...3 С (10 -4 ...10 -6) анализируют после проведения специальных приемов концентрации с помощью упаривания, сжигания веществ с последующим определением одним из физико-химических методов, исходя из его разрешающей способности. При более чем 3 С разведении (10 -6) достаточно установить подлинность лекарственного средства, содержащегося в одной разовой или суточной дозе. При очень высоких разведениях (до 50 С или 10 -10 ...10 -100) контроль качества гомеопатических средств существующими методами выполнить невозможно. Для таких лекарств контроль качества осуществляют на стадии получения, строго контролируя технологический процесс. Качество контролируют при закладке ингредиентов и фиксируют в акте загрузки. Каждый ингредиент подвергают предварительному анализу. Во всех перечисленных случаях для анализа и стандартизации гомеопатических лекарственных средств используют хроматографические, фотометрические, флуоресцентные и другие методы.

УДК 615.015:615.07:53

АНАЛИЗ ЛЕКАРСТВЕННЫХ СРЕДСТВ ПРИ ФАРМАКОКИНЕТИЧЕСКИХ

ИССЛЕДОВАНИЯХ

Дмитрий Владимирович Рейхарт1, Виктор Владимирович Чистяков2

Кафедра организации и управления в сфере обращения лекарственных средств (зав. - чл.-корр. РАМН, проф. Р.У. Хабриев) Московской государственной медицинской академии им. И.М. Сеченова,

2 Центр по химии лекарственных средств - ВНИХФИ (ген. директор - К.В. Шилин), г. Москва

Проведен обзор чувствительных и специфичных аналитических методов, применяемых при изучении фармакокинетики лекарственных препаратов. Показаны достоинства и ограничения применения имму-ноферментного анализа, метода высокоэффективной жидкостной хроматографии с флуоресцентной и масс-спектрометрической детекцией. Применение того или иного метода при оценке фармакокинетики лекарственных препаратов в каждом конкретном случае определяется структурой исследуемого соединения и оснащенностью лаборатории.

Ключевые слова: жидкостная хроматография, флюоресцентная и масс-спектрометрическая детекция, иммуноферментный анализ, фармакокинетика.

Изучение фармакокинетики основано главным образом на оценке концентрации в организме пациента лекарственного вещества (ЛВ) в определенные моменты времени после приема препарата. Объектом исследования служат кровь (цельная, сыворотка, плазма), моча, слюна, кал, желчь, амниотическая жидкость и др. Наиболее доступны и чаще исследуются образцы крови и мочи.

Измерение концентрации ЛВ можно разделить на два этапа: 1 - выделение конкретного лекарственного вещества из биологического объекта, концентрирование исследуемого соединения, отделение его от основных эндогенных компонентов; 2 - разделение смеси соединений, идентификация ЛВ и количественный анализ.

Изучение концентрации препарата в крови дает информацию о продолжительности циркуляции лекарства в организме, биодоступности препарата, влиянии концентрации на фармакологический эффект, терапевтической и летальной дозах, динамике образования активных или токсичных метаболитов.

Изучение концентрации препарата в моче позволяет оценить скорость элиминации ЛВ и функцию почек. Концентрация метаболитов в моче - косвенный показатель активности метаболизирующих ферментов.

Исследование биологического материала включает измерение массы (объема) пробы, высвобождение препарата (метаболитов) из 532

клеток пробы, отделение целых клеток (например, при анализе крови) или частей клеток (при анализе гомогенатов тканей), добавление внутреннего стандарта, отделение белков, очистку пробы (центрифугирование, фильтрация), процедуры экстракции, реэкстракции, концентрирования и превращения исследуемых веществ в удобные для анализа производные, основные процедуры обработки проб крови и мочи соответственно (рис. 1).

«Идеальный» аналитический метод измерения концентрации ЛВ должен обладать высокой чувствительностью, специфичностью и воспроизводимостью, возможностью работы с малыми объемами, простотой подготовки материала, дешевизной и легкостью обслуживания оборудования, надежностью и возможностью автоматизации, простотой работы персонала и универсальностью (возможность анализа различных классов ЛВ).

Для получения достоверных данных необходимо делать поправку на стабильность действующего вещества и/или продукта (продуктов), а также степень его биотрансформации в анализируемых биологических средах .

Валидация метода должна проводиться c учетом его предполагаемого применения, при калибровке следует учитывать диапазон концентраций исследуемого образца. Категорически не рекомендуется применять два или более метода анализа проб в одном и том же материале со сходным диапазоном калибровочных значений.

Существует большое число методов определения концентрации ЛВ в биологических жидкостях: xроматографические, микробиологические, спектрофотометрические, полярографические, иммунологические (радиоим-мунные, иммуноэнзимные), радиоизотопные и другие методы.

Критическими параметрами метода являются чувствительность, скорость, точность, возможность работы с малым объемом биоматериала и стоимость.

В табл. 1 сравниваются аналитические методы анализа ЛВ .

Наиболее широко (до 95% исследований) на практике применяется метод высокоэффектив-

Рис. 1. Основные процедуры обработки проб крови и мочи.

ной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) с различными видами детекции.

Преимуществами ВЭЖХ по сравнению, например, с методом газожидкостной хроматографии (ГЖХ) являются отсутствие ограничений по термостабильности анализируемых препаратов, возможность работы с водными растворами и летучими соединениями, использования вариантов «нормальнофазной» и «обращеннофазной» хроматографии. Многие из видов детекции являются неразрушающи-

иммуноферментный, ВЭЖХ с флуоресцентной детекцией, ВЭЖХ с масс-спектрометрической детекцией, которые в настоящее время активно применяются в фармакокинетических исследованиях.

Иммуноферментный метод

Метод иммуноферментного анализа (ИФА) предложен в начале 70-х годов прошлого столетия. Принцип ИФА заключается во взаимодействии специфических белковых ан-

Сравнительная характеристика методов анализа лекарственных средств

Методы Абсолютная чувствительность, г Чувст- витель- ность, баллы Слож- ность, баллы Избира- тельность, баллы Универ- сальность Сум- марная оценка, баллы

Жидкостная хроматография:

УФ-детектор 10-7 3 -3 4 4 8

флуоресцентный детектор 10-8 - 10-9 4 -3 5 2 8

масс-спектрометрический детектор 10-11 - 10-12 5 -5 5 4 9

Иммунологические 10-10 - 10-11 5 -1 4 1 9

Газовая хроматография:

электронозахватный детектор 10-10 5 -4 4 2 7

пламенно-ионизационный детектор 10-8 - 10-9 4 -3 2 4 7

ми; методы детекции, используемые в ВЭЖХ, обладают более высокой специфичностью.

Рассмотрим особенности высокочувствительных методов, позволяющих анализировать нанограммовые количества ЛВ (табл.1):

тител с анализируемым веществом, выступающим в роли антигена. Чем выше концентрация вещества-антигена, тем больше образуется комплексов антиген-антитело. Для количественного анализа комплексообразования при-

меняют два подхода - с предварительным отделением комплекса (гетерогенные методы) или без его отделения (гомогенные методы). В том и другом случае пробу с неизвестной концентрацией анализируемого вещества добавляют к сыворотке, в которой антитело связано в комплекс с меченным аналогом исследуемого вещества, и вещество из анализируемой пробы вытесняется из комплекса. Количество вытесненного меченного аналога пропорционально концентрации вещества в пробе. Определив, сколько меченного аналога оказалось вытеснено из комплекса (или, напротив, осталось связанным), можно рассчитать искомый уровень вещества в пробе. Предварительно проводится калибровка с использованием стандартных растворов (со стандартными концентрациями тестируемого вещества).

Выпускаются наборы реактивов - так называемые диагностикумы (антисыворотка, соединенный с препаратом фермент, субстрат, кофактор, стандартные растворы для калибровки), рассчитанные на 50-200 анализов. Для анализа обычно достаточно 0,05-0,2 мл сыворотки крови больного.

Иммуноэнзимные методы обладают высокой чувствительностью и специфичностью. Диагностикумы сравнительно дешевые и имеют более продолжительные сроки годности, чем наборы для радиоиммунных методов. При использовании ИФА устраняется необходимость отделения комплекса антиген-антитело - достаточно сложной процедуры, с относительно высоким риском ошибки. Им-муноэнзимный метод может выполняться в любой больничной или поликлинической лаборатории; разработаны приборы, обеспечивающие полную автоматизацию анализа.

Простота анализа, высокая чувствительность, точность, воспроизводимость,

умеренная цена аппаратуры и реактивов - все это создает перспективу для широкого внедрения иммунологических методов в медицинскую практику.

Высокоэффективная жидкостная хромотография с флуоресцентной детекцией

При ВЭЖХ детектор генерирует электрический сигнал, сила которого пропорциональна концентрации анализируемого вещества, растворенного в подвижной фазе. В первых жидкостных хроматографах (ионообменных) прошедшая через колонку подвижная фаза с компонентами пробы собиралась в небольшие сосуды, а затем при помощи титрометрии, колориметрии, полярографии и т.д. определялось содержание компонента в этой порции. Иными словами, процессы разделения пробы

и определения ее количественного состава были разделены во времени и пространстве. В современном жидкостном хроматографе эти процессы обеспечиваются одним прибором.

Для детекции компонентов пробы может быть использовано любое физико-химическое свойство подвижной фазы (поглощение или излучение света, электропроводность, показатель преломления и т.д.), которое изменяется при наличии в ней молекул разделяемых соединений. Из существующих 50 физико-химических методов детекции в настоящее время активно используется 5-6.

Чувствительность-важнейшая характеристика детектора. Если определять чувствительность через двойную амплитуду шума нулевой линии, а шум выражать в физических единицах, то чувствительность фотометрического детектора будет выражаться в единицах оптической плотности, рефрактометрического - в единицах показателя преломления, вольтам-перометрического - в амперах, кондуктомет-рического - в сименсах. В фармацевтическом анализе чувствительность выражают в минимальном количестве определяемого вещества. Степень чувствительности различных типов детекторов приведена в табл. 1.

Несмотря на то что в настоящее время 80% хроматографов оснащено в базовой комплектации спектрофотометрическими детекторами, всё большее распространение получает флуоресцентная детекция, особенно при определении концентрации соединений, способных «светиться» под действием возбуждающего излучения. Интенсивность люминесценции пропорциональна интенсивности возбуждающего света. Исследование спектров испускания (флуоресценции и фосфоресценции) - более чувствительный и специфичный метод, чем исследование спектров поглощения.

Спектр флуоресценции вещества во многих случаях представляет собой зеркальное отражение полосы поглощения с наименьшей энергией и обычно располагается рядом с этой полосой с её длинноволновой стороны. Данный метод наиболее удобно применять при исследовании лекарственных препаратов, обладающих собственной флуоресценцией (хлорохин, доксорубицин, доксазо-зин, атенолол, индометацин, пропранолол, тетрациклины, хинидин и др.). Некоторые ЛВ можно сравнительно легко превратить во флуоресцирующие соединения (процесс дериватизации), например гидрокортизон (обработка серной кислотой), меперидин (конденсация с формальдегидом), 6-меркап-топурин и метотрексат (окисление перманганатом калия). Другие препараты с активными функциональными группами можно конденсировать с флуоресцирующими реа-

гентами - флуорескамином (хлордеазепок-сид, новокаинамид, сульфаниламиды и др.), 7-нитробензо-2,1,3-оксадиазолом (пропокси-фен и др.) и т.д. Вместе с тем необходимо отметить, что при высокой чувствительности и селективности флуоресцентные методы детектирования ограничены кругом ЛВ, имеющих естественную флуоресценцию, а процесс дериватизации при количественном анализе требует больших затрат.

Высокоэффективная жидкостная хроматография с масс-спектрометрической детекцией

Высокочувствительным вариантом современного детектора для ВЭЖХ, применяемого для фармакокинетических исследований, является масс-спектрометрометр. Масс-спектрометрический детектор позволяет значительно сократить время анализа, в частности за счет исключения подготовительной стадии (экстракции). Данный метод дает возможность одновременно идентифицировать несколько веществ, и это исключает ошибки, связанные с наличием неразделяемых компонентов.

Масс-спектрометрия - один из наиболее перспективных методов физико-химического анализа лекарственных средств. Традиционно органическая масс-спектрометрия используется для решения двух основных проблем: идентификации веществ и изучения фрагментации ионизированных молекул в газовой фазе. Соединение масс-спектрометра с жидкостным хроматографом значительно расширило возможности классического метода. С появлением новых методов ионизации, таких как «электроспрей» (ESI - англ. electrospray ionization) - ионизация в электрическом поле при атмосферном давлении) и «МАЛДИ» - ионизация лазерной десорбцией, список молекул, которые могут быть изучены данным методом, значительно расширился.

В настоящее время комбинация ВЭЖХ и масс-спектрометрического детектора с «электроспреем» нашла широкое распространение в исследовании фармакокинетики и биоэквивалентности лекарственных препаратов . Первоначально метод ESI был разработан под руководством Л.Н. Галль , а в 2002 г. Д. Фен-ну и К. Танаке была присуждена Нобелевская премия за разработку методов индентифика-ции и структурного анализа биологических макромолекул и, в частности, методов масс-спектрометрического анализа биологических макромолекул. В механизме образования ионизированных частиц выделяют три стадии. Первая - образование заряженных капель на срезе капилляра. Посредством приложенного напряжения происходит перераспределение заряда в растворе, положительные ионы скап-

ливаются у выхода. При сильном приложенном поле (3-5 кВ) образуется струя из вершины конуса, которая далее разлетается на мелкие капли. Вторая стадия - постепенное сокращение размеров заряженных капель за счет испарения растворителя и последующего распада капель вплоть до получения истинных ионов. Заряженные капли движутся сквозь атмосферу по направлению к противоположному электроду. Третья стадия - повторяющиеся циклы разделения и уменьшения объема капель до полного испарения растворителя и образования ионов в газовой фазе.

Современные ЖХ-МС системы (LC/MS - англ. liquid chromatography/mass-spectrometry) позволяют регистрировать полный ионный ток (TIC - англ. total ion current), проводить контроль заданных ионов (SIM - англ. selected ion monitoring) и контроль заданных реакций селективное мониторирование реакции (SRM - англ. selected reaction monitoring).

При анализе полного ионного тока (TIC) получают данные обо всех соединениях, последовательно выходящих из хроматографической колонки. Масс-хроматограммы напоминают хроматограммы с УФ-детекцией, при этом площадь под пиком соответствует количеству вещества. При определении заданных ионов (SIM) оператор может ограничить диапазон детекции необходимых соединений выделив, например, минорные вещества. Наибольшей чувствительностью и специфичностью обладает SRM-метод, когда регистрация ионного тока идет по одному выбранному иону, характерному для исследуемого соединения (при ESI-ионизации и регистрации положительных ионов это, как правило, - молекулярный ион МН+).

В недавно опубликованных работах обсуждается возможность количественного анализа органических веществ в биологических объектах без хроматографического разделения с помощью мультионной детекции и внутреннего контроля в виде меченного дейтерием аналога . В частности, для молекул липидной природы определен диапазон концентраций (от пико- до наномолей), при котором авторы наблюдали линейную зависимость интенсивности ионного тока от концентрации вещества. Увеличение концентрации соединений в растворе приводило к ион-молекулярным взаимодействиям в процессе ионизации и нарушению линейности.

Описан метод количественного определения простагландинов и полиненасыщен-ных жирных кислот с использованием электроспрей-ионизации - масс-спектрометрии без хроматографического разделения с применением внутреннего стандарта и регистрации отрицательных ионов . В работе

Ю.О. Каратассо и И. В. Логуновой чувствительность масс-спектрометрии при исследовании потенциального антиаритмического средства составила 3 нг/0,5 мл плазмы крови.

При выборе аналитического метода необходимо иметь в виду, что использование ИФА лимитируется наличием обязательных реактивов, флуоресцентной детекции, необходимостью собственной флуоресценции у исследуемого соединения. Хотя при масс-спектрометрической детекции вышеуказанные ограничения несущественны, однако стоимость оборудования на сегодняшний день остается достаточно высокой, и данный вид анализа требует специальных навыков.

ЛИТЕРАТУРА

1. Александров М.Л., Галль Л.Н., Краснов Н.В. и др. Экстракция ионов из растворов при атмосферном давлении - новый метод масс-спектрометрического анализа // Докл. Акад. наук СССР. - 1984. - Т.277. - № 2. -

2. Каратассо Ю.О, Логунова И. В., Сергеева М. Г. и др. Количественный анализ лекарственных препаратов в плазме крови с использованием электроспрей ионизации - масс-спектрометрии без хроматографического разделения // Хим. фарм. журн. - 2007. - № 4. - С. 161-166.

3. Каратассо Ю.О, Алёшин С.Е., Попова Н.В. и др. Количественный анализ простагландинов и полине-насыщенных жирных кислот методом масс-спектро-метрии с ионизацией электрораспылением // Масс-спектрометрия. -2007. - Т.4. - В.3. - С. 173-178.

4. Холодов Л.Е, Яковлев В.П. Клиническая фармакокинетика. - М.:Медицина, 1985. - 463 с.

5. Covey T.R., Lee E.D., Henion J.D. High-speed liquid chromatography/tandem mass spectrometry for the determination of drugs in biological samples // Anal. Chem. - 1986. - Vol. 58 (12). - P. 2453-2460.

6. Conference report on analytical methods validation: bioavailability, bioequivalence and pharmacokinetic studies // J. Pharmac. sci. - 1992. - Vol.81. - P. 309-312.

7. De Long C.J., Baker P.R.S., SamuelM. et al. Molecular species composition of rat liver phospholipids by ESI-MS/ MS: The effect of chromatography//J. Lipid Res. - 2001. - Vol. 42. - P. 1959-1968.

8. Electrospray Ionization Mass Spectrometry. Ed. R.B.Cole // Wiley. - New York, 1997.

9. Han X., Yang K., Yang J. et al. Factors influencing the electrospray intrasource separation and selective ionization of glycerophospholipids // Am. Soc. Mass Spectrom. - 2006. - Vol. 17(2). - P. 264-274.

10. Koivusalo M., Haimi P., Heikinheimo L. et al. Quantitative determination of phospholipids compositions by ESI-MS: Effects of acyl chain length, unsaturation, and lipid concentration on instrument response // J. Lipid Res. - 2001. - Vol. 42. - P. 663-672.

11. Lee M.S., Kerns E.H. LC/MS applications in drug discovery//Mass Spectrom. Rev. - 1999. - Vol. 18 (3-4). - P. 187-279.

Поступила 28.05.10.

ANALYSIS OF DRUGS IN PHARMACOKINETIC STUDIES

D.V. Reikhart, V.V. Chistyakov

Conducted was a review of sensitive and specific analytical methods for studying the pharmacokinetics of drugs. Shown were the advantages and limitations of immune-enzyme analysis, of high performance liquid chromatography with fluorescence and mass spectrometric detection. The usage of a method in the evaluation of the pharmacokinetics of drugs in each case should be determined by the structure of the compound and the laboratory equipment.

Key words: liquid chromatography, fluorescence and mass spectrometric detection, immune-enzyme analysis, pharmacokinetics.

5 / 5 ( голосов: 1 )

Сегодня довольно часто можно обнаружить некачественные лекарства и таблетки-пустышки, которые вызывают у потребителя сомнения по поводу их эффективности. Существуют определенные методы анализа лекарственных средств, позволяющие с максимальной точностью определить состав лекарства, его характеристики, а это позволит выявить степень влияния лекарственного средства на организм человека. Если у вас есть определенные жалобы на лекарственный препарат, тогда его химическая экспертиза и объективное заключение могут быть доказательством в любом судебном разбирательстве.

Какие методы анализа лекарственных средств используют в лабораториях?

Для установления качественных и количественных характеристик лекарства в специализированных лабораториях широко применяют такие методы:

• Физические и физико-химические, которые помогают определить температуру плавления и затвердевания, плотность, состав и чистоту примесей, найти содержание тяжелых металлов.
• Химические, определяющие наличие летучих веществ, воды, азота, растворимость лекарственного вещества, его кислотное, йодное число и т. д.
• Биологические, позволяющие испытать вещество на стерильность, микробную чистоту, содержание токсинов.

Методы анализа лекарственных средств позволят установить подлинность заявленного производителем состава и определят малейшие отклонения от норм и технологии производства. В лаборатории АНО «Центр химических экспертиз» есть все необходимое оборудование для точного исследования любого вида лекарства. Высококвалифицированные специалисты применяют разнообразные методы анализа лекарственных средств и в кратчайшие сроки предоставят объективное заключение экспертизы.